Sabtu, 13 November 2010

IDENTIFIKASI KANDUNGAN ASAM AMINO PADA PUTIH TELUR DENGAN UJI MILLON, HOPKINS-COLE, NINHIDRIN, PbS DAN REAKSI NITROPRUSIDA

I Kadek Agus Tarsana, 0613031035


 

ABSTRAK

Asam-asam amino yang secara alami menyusun protein mempunyai gugus fungsi amino (-NH2) dan karboksil ( -COOH) yang terikat pada atom karbon yang sama yaitu pada atom karbon alfa. Oleh karena itu, asam-asam amino ini disebut α-amino

Pada praktikum ini dilakukan identifikasi asam amino yang terdapat pada larutan protein. Identifikasi tersebut dilakukan dengan uji Millon, Uji Hoppkins-Cole, uji Ninhidrin, Uji dengan PbS dan reaksi Nitroprusida.

    Pada uji Millon, uji positif ditunjukkan oleh asam amino tirosin. Hal ini ditandai dengan terbentuknya endapan yang berwarna merah. Untuk uji Hopkins-Cole, uji positif ditunjukkan oleh asam amino triptofan yang ditandai oleh terbentuknya cincin ungu. Pada uji dengan Ninhidrin semua sampel asam amino menunjukkan uji positif yang ditandai oleh terbentuknya larutan berwarna biru. Uji PbS dan reaksi Nitroprusida menunjukkan uji positif terhadap sistein. Ini ditandai dengan terbentuknya larutan hitam pada uji PbS dan larutan merah pada reaksi nitroprusida.


 

  1. PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang

Dalam kehidupan sehari-hari kita melakukan aktivitas. Untuk melakukan aktivitas itu, kita memerlukan energi yang dapat diperoleh dari bahan makanan yang kita makan. Pada umumnya bahan makanan itu mengandung tiga kelompok utama senyawa kimia, yaitu karbohidrat, protein, dan lemak.

Protein merupakan makromolekul yang paling berlimpah di dalam sel dan menyusun lebih dari setengah berat kering pada hampir semua organisme. Protein merupakan instrumen yang mengekspresikan informasi genetik. Protein mempunyai fungsi unik bagi tubuh, antara lain menyediakan bahan-bahan yang penting peranannya untuk pertumbuhan dan memelihara jaringan tubuh, mengatur kelangsungan proses di dalam tubuh, dan memberi tenaga jika keperluannya tidak dapat dipenuhi oleh karbohidrat dan lemak.

Protein merupakan biopolymer yang multifungsi, yaitu sebagai struktural pada sel maupun jaringan dan organ, sebagai enzim suatu biokatalis, sebagai pengemban atau pembawa senyawa atau zat ketika melalui biomembran sel, dan sebagai zat pengatur. Protein merupakan biopolymer polipeptida yang tersusun dari sejumlah asam amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida.

Asam amino merupakan molekul organik dengan massa molekul rendah (antara 100-200 Da). Asam amino ini merupakan komponen penting untuk biosintesis protein. Dalam protein terdapat sekitar 20 jenis asam amino standar. Semuanya merupakan asam α-amino, kecuali prolin dan hidroksi prolin. Variasi yang terjadi antara asam-asam amino terletak pada gugus R atau rantai sampingnya. Berdasarkan gugus R-nya akan dapat diramalkan sifat-sifat suatu asam amino. Sebaliknya, berdasarkan sifat-sifat yang teridentifikasi akan dapat diketahui gugus R yang terkandung dalam asam amin tersebut atau akan diketahui jenis asam amino tersebut.


 


 

Gambar 1.1 Struktur asam α-amino


 

Berdasarkan struturnya, asam amino diklasifikasikan menjadi tujuh kelompok. Klasifikasi ini didasarkan pada sifat kimia dari gugus R-nya sehingga akan memudahkan dalam mengingat sifat-sifat umum dari setiap asam amino. Dengan klasifikasi ini, metode untuk analisa suatu asam amino tertentu.

Tabel 1.1 Klasifikasi Asam Amino Berdasarkan struktur Kimianya

Sifat Gugus R 

Contoh Asam Amino 

Alifatik 

Gly, Ala, Val, Leu, Ile 

Aromatik 

Phe, Tyr, Trp 

Hidrosiklik 

Ser, Thr 

Karbosiklik 

Asp, Glu 

Mengandung sulfur 

Cys, Met 

Imino 

Pro, Hyp 

Amino 

Lys, Arg 

Amida 

Asn, Gln 

Tabel 1.2 Beberapa Reaksi untuk Mendeteksi Asam Amino berdasarkan Gugus R

Reaksi Uji 

Reaksi/reagen 

Asam Amino yang dideteksi 

Warna 

Reaksi Millon 

HgNO3 dalam asam nitrat dengan sedikit asam nitrit

Tirosin 

Merah 

Reaksi Nanthoprotein

Pendidihan dalam asam nitrat

Tirosin, triptofan, fenilalanin

Kuning

Reaksi Hopkins-Cole

Asam glioksilat dalam H2SO4 pekat

Tryptopan

Ungu

Reaksi Sakaguci

α-naftol dan natrium hipoklorit

Arginin

Merah

Reaksi Nitroprusida

Natrium nitroprusida dalam NH3 encer

Sistein

Merah

Reaksi Pauli

Asam sulfanilat terdiazotasi dalam larutan basa

Histidin dan tirosin

Merah

Reaksi Folin-Ciocalteu 

Asam fosfomolibdat 

Tirosin  

Biru 


 

I.2 Tujuan

        Mengidentifikasi jenis-jenis asam amino yang terdapat pada larutan albumin telur melalui uji Millon, Uji Hopkins-Cole, Uji Ninhidrin, Uji PbS, dan reaksi Nitoprusida.


 

  1. METODE

Uji asam amino yang dilakukan percobaan ini adalah uji Millon, uji Hopkins-Cole, uji Ninhidrin, Uji PbS dan reaksi Nitroprusida.

  1. Uji Millon

Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat. Apabila pereaksi ini ditambahkan ke dalam larutan protein yang mengandung asam amino dengan rantai samping gugus fenolik, akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan. Tetapi khusus untuk proteosa dan pepton secara langsung akan menghasilkan larutan berwarna merah. Endapan yang terbentuk berupa garam kompleks dari tirosin yang ternitrasi. Jika larutan protein yang dianalisis ada dalam sussana basa, maka terlebih dahulu harus dinetralisasi dengan asam, karena dalam basa ion merkuri dalam pereaksi akan mengendap sebagai Hg(OH)2. Pada penetralan ini digunakan asam selain HCl, karena ion Cl- dapat bereaksi dengan asam nitrat menghasilkan radikal klor (Cl.). Radikal klor dapat merusak kompleks berwarna. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksi fenil yang berwarna. Protein yang mengandung tirosin akan memberikan hasil yang positif.


 


 

Gambar 1.2 Struktur tirosin


 

Alat dan Bahan

Nama Alat 

Jumlah 

Nama Bahan 

Jumlah 

Tabung reaksi

Pipet tetes

Gelas kimia 25 mL

Gelas ukur 5 mL

Lampu spritus

1 rak

1 buah

1 buah

1 buah

1 buah

Larutan albumin

Reagen Millon

Sistein

Fenilalanin

Glisin

Tirosin

Triptofan

Secukupnya

Secukupnya

Secukupnya

Secukupnya

Secukupnya

Secukupnya

Secukupnya

Prosedur Kerja

  1. Sebanyak 5 tetes reagen Millon ditambahkan ke dalam 3 mL larutan protein kemudian dipanaskan.
  2. Sebanyak 5 tetes reagen millon ditambahkan pada masing-masing 3 mL larutan tyrosin, tripthopan, phenilalanin, glisin dan sistein, kemudian dipanaskan.


 

  1. Uji Hopkins-Cole

Reagen Hopkins-Cole mengandung asam glioksilat (HOOC-CHO). Jika reagen ini ditambahkan ke dalam larutan senyawa yang mengandung cincin indol dan ditambah larutan asam sulfat pekat, maka akan terbentuk cincin ungu pada interfase kedua cairan tersebut. Karena triptofan merupakan satu-satunya asam amino yang mengandung cincin indol, maka uji ini dipakai untuk identifikasi asam amino triptofan dan protein yang mengandung asam amino triptofan. Cincin ungu yang tampak pada bidang batas antara kedua cairan adalah hasil kondensasi ttiptofan dengan gugus aldehida dari asam glioksilat dalam suasana asam pekat.


 

Gambar 1.3 asam 2,3,4,5-tetrahidro-β-karbolin-4 karboksilat


 

Alat dan Bahan

Nama Alat 

Jumlah 

Nama Bahan 

Jumlah 

Tabung reaksi

Pipet tetes

Gelas kimia 25 mL

Gelas ukur 5 mL

1 rak

1 buah

1 buah

1 buah

Larutan albumin

Reagen Hopkins-Cole

Larutan asam sulfat

Sistein

Fenilalanin

Glisin

Tirosin

Triptofan 

Secukupnya

Secukupnya

Secukupnya

Secukupnya

Secukupnya

Secukupnya

Secukupnya

Secukupnya

Prosedur Kerja

  1. Larutan albumin sebanyak 2 mL ditambahkan dengan 2 mL reagen Hopkins-Cole. Lalu, ditambahkan lagi dengan larutan asam sulfat pekat melalui sisi tabung sampai kira-kira 5 mL dan bila perlu putar perlahan-lahan. Warna yang terbentuk pada pertemuan kedua cairan diamati.
  2. Masing-masing 2 mL larutan tyrosin, phenilalanin, tripthopan, glisin dan sistein ditambahkan dengan 2 mL reagen Hopkins-Cole. Lalu, ditambahkan lagi dengan larutan asam sulfat pekat melalui sisi tabung sampai kira-kira 5 mL dan bila perlu putar perlahan-lahan. Warna yang terbentuk pada pertemuan kedua cairan diamati.


 

  1. Uji Ninhidrin

Apabila ninhidrin (triketohidrin) dipanaskan bersama asam amino, maka akan terbentuk kompleks berwarna biru. Kompleks berwarna biru dihasilkan dari reaksi ninhdrin dengan hasil reduksinya, yaitu hidrindantin dan amonia. Asam amino dapat ditentukan secara kuantitatif dengan jalan mengamati intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi asam amino tersebut. Pada reaksi ini, dilepaskan CO2 dan NH4 sehingga asam amino asam amino dapat ditentukan secara kuantitatif dengan mengukur jumlah CO2 dan NH3 yang dilepaskan. Prolin dan hidroksi prolin menghasilkan kompleks yang berbeda warnanya dengan asam amino lainya. Kompleks berwarna yang terbentuk mengandung dua molekul ninhidrin yang bereaksi dengan amonia yang dilepaskan pada oksidasi asam amino.

Keseluruhan reaksi asam amino dengan ninhidrin adalah sebagai berikut:

  1. dekarboksilasi oksidatif dari asam amino dan produksi ninhidrin tereduksi, amoniak dan dioksida,
  2. reaksi ninhidrin tereduksi dengan molekul ninhidrin yang lain dengan molekul amoniak yang dihasilkan,
  3. pembentukan kompleks berwarna biru.


 


 

    Ninhidrin                Ninhidrin tereduksi


 


 

Gambar 1.3 Reaksi Ninhidrin


 

Alat Dan Bahan

Nama Alat 

Jumlah 

Nama Bahan 

Jumlah 

Tabung reaksi

Pipet tetes

Gelas kimia 25 mL

Gelas ukur 5 mL

Lampu spritus

1 rak

1 buah

1 buah

1 buah

1 buah 

Larutan albumin

Larutan Ninhidrin

Sistein

Fenilalanin

Glisin

Tirosin

Triptofan 

Secukupnya

Secukupnya

Secukupnya

Secukupnya

Secukupnya

Secukupnya

Secukupnya

Prosedur Kerja

  1. Ke dalam 3 mL larutan protein ditambahkan dengan 0,5 mL larutan ninhidrin 0,1% kemudian panaskan hingga mendidih.
  2. Ke dalam masing-masing 3 mL larutan tyrosin, tripthopan, phenilalanin, glisin dan sistein ditambahkan dengan 0,5 mL larutan ninhidrin 0,1% kemudian panaskan hingga mendidih. Perubahan warna yang terjadi diamati.


 

  1. Uji PbS

Belerang yang terdapat dalam asam amino sistein dibebaskan sebagai ion sulfida dengan kehadiran NaOH. Ion sulfida bereaksi dengan Pb2+ membentuk endapan hitam. Reaksinya:

S2+(aq) + Pb2+(aq)      PbS(s)


 

Alat dan Bahan

Nama Alat 

Jumlah 

Nama Bahan 

Jumlah 

Tabung reaksi

Pipet tetes

Gelas kimia 25 mL

Gelas ukur 5 mL

Lampu spritus

1 rak

1 buah

1 buah

1 buah

1 buah 

Larutan albumin

Larutan Pb-Asetat

Larutan NaOH

Sistein

Secukupnya

Secukupnya

Secukupnya

Secukupnya

Prosedur Kerja

  1. Sebanyak 5 mL larutan sistein ditambahkan dengan 2 mL NaOH dan larutan Pb-asetat. Kemudian panaskan di dalam penangas air.


 

  1. Reaksi Nitroprusida

Pada asam amino sistein, selain terdapat gugus –COOH ,gugus –NH2 dan gugus R pada asam amino sistein juga terdapat –SH bebas (gugus sulfidril) bila bereaksi dengan natrium nitroprusida dalam amonia berlebih menghasilkan kompleks berwarna merah. Beberapa protein yang memberikan hasil negatif terhadap uji ini, ternyata menjadi positif setelah dipanaskan sampai mengalami koagulasi atau denaturasi. Hal ini menunjukkan proses tersebut menghasilkan gugus –SH bebas.

Reaksi:

[Fe3+(CN)3NC]2- + NH3 + RSH        NH4+ + [Fe2+ (CN)5NOSR]2-

                        Kompleks berwarna merah

Alat dan Bahan

Nama Alat 

Jumlah 

Nama Bahan 

Jumlah 

Tabung reaksi

Pipet tetes

Gelas kimia 25 mL

Gelas ukur 5 mL

1 rak

1 buah

1 buah

1 buah

Larutan albumin

Larutan Natriumprusida

Laruta sistein 

Secukupnya

Secukupnya

Secukupnya

Posedur Kerja

  1. Kristal sistein hidroksida dilarutkan ke dalam air, kemudian ditambah dengan nitropusida lalu ditambah lagi dengan larutan amoniak. Perubahan yang terjadi diamati.

    
 

                    

  1. PEMBAHASAN
  1. Uji Millon

Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat, bila direaksikan dengan senyawa yang mengandung gugus fenol akan membentuk endapan merah dengan pemanasan. Pada pengujian asam amino dengan uji Millon, larutan protein (albumi telur) ditambahkan dengan reagen Millon. Penambahan reagen Millon ini menyebabkan terbentuknya endapan putih yang kemudian berubah menjadi endapan merah. Hal ini membuktikan dalam larutan albumin tersebut positif mengandung tirosin.

Endapan putih yang terbentuk setelah penambahan reagen Millon pada larutan protein tersebut berasal dari endapan merkuri, dimana pada awalnya Hg yang terlarut di dalam HNO3 teroksidasi menjadi Hg+. Ion Hg + ini selanjutnya membentuk garam dengan gugus karboksil dari tirosin. Adapun reaksinya adalah sebagai berikut:


 


 

                        Endapan putih dari garan proteinat


 

Ketika dipanaskan endapan putih tersebut berubah menjadi endapan merah. Hal ini terjadi karena asam nitrat yang semula berfungsi sebagai pelarut mengoksidasi Hg + menjadi Hg2+. Bersamaan dengan hal tersebut, asam amino tirosin ternitrasi. Kemudian terjadi reaksi pembentukan HgO yang berwarna merah. Adapun persamaan reaksinya adalah sebagai berikut:


 

Untuk membuktikan bahwa dalam larutan albumin terdapat asam amino tirosin, maka dilakukan uji terhadap beberapa asam amino standar yang ada di laboratorium. Asam amino standar yang digunakan adalah fenilalanin, tirosin, glisin, sistein dan tiptofan. Pada pengujian dengan fenilalanin, glisin, sistein dan tiptofan tidak terbentuk endapan merah. Hal ini disebabkan karena pada keempat asam amino tersebut tidak mengandung gugus fenol. Pada pengujian dengan tirosin, setelah penambahan reagen Millon dan pemanasan tidak terjadi perubahan warna. Padahal, seharusnya terbentuk endapan merah yang dapat membuktikan bahwa dalam laruta albumin terdapat asam amino tirosin. Hal ini kemungkinan terjadi karena penambahan reagen Millon yang terlalu banyak.


 

  1. Uji Hopkins-Cole

Reagen Hopkins-Cole mengandung asam glioksilat (HOO-CHO). Jika reagen tersebut ditambahkan dengan senyawa yang mengandung cincin indol dan ditambahkan dengan asam sulfat maka akan membentuk cincin ungu pada interfase kedua cairan tersebut.. Pada pengujian asam amino dengan uji Hopkins-Cole, larutan albumin ditambahkan dengan reagen Hopkins-Cole dan asam sulfat. Penambahan tersebut menyebabkan terbentuknya dua lapisan dan terbentuk cincin ungu pada bidang batas antara kedua lapisan tersebut. Hal ini menunjukkan bahwa di dalam larutan albumin positif mengandung triptofan, karena triptofan merupakan satu-satunya asam amino yang mengandung gugus indol. Cincin ungu yang terbentuk merupakan hasil kondensasi triptofan dengan gugus aldehida dari asam glioksilat dalam suasana asam sulfat. Adapun persamaan reaksinya adalah sebagai berikut:


 

    Triptofan         Asam glioksilat Asam-2,3,4,5-tetrahidro-β-karbolin-4-karboksilat

Penambahan asam sulfat dalam reaksi ini berfungsi sebagai oksidator dan juga sebagai dehidrator bagi asan glioksilat.

Untuk membuktikan bahwa dalam larutan albumin terdapat asam amino triptofan, maka dilakukan uji terhadap beberapa asam amino standar yang ada di laboratorium. Asam amino standar yang digunakan adalah Fenilalanin, tirosin, glisin, sistein dan triptofan. Pada pengujian dengan fenilalanin, tirosin, glisin dan sistein, tidak terjadi perubahan dan tidak terbentuk cincin ungu setelah asam-asam amino tersebut ditambahkan dengan reagen Hopkins-Cole dan asam sulfat. Hal tersebut terjadi karena kekempat asam amino tersebut tidak mengandung gugus indol. Pada pengujian dengan triptofan, terbentuk dua lapisan dan terbentuk cincin ungu di tengah-tengahnya setelah penambahan reagen Hopkins-Cole dan asan sulfat. Hal ini membuktikan bahwa di dalam larutan albumin terdapat asam amino triptofan.


 

  1. Uji Ninhidrin

Uji ninhidrin dipergunakan untuk identifikasi asam α-amino dan peptida yang memiliki gugus α-amino bebas. Ninhidrin jika ditambahkan dengan asam amino dan dipanaskan akan membentuk kompleks berwarna biru, kecuali pada prolin dan hidroksi prolin yang gugus aminanya tersubstitusi, memberikan hasil berwarna kuning. Adapun persamaan reaksinya adalah sebagai berikut:


 

Ninhidrin     asam amino    ninhidrin tereduksi


 

                            Kompleks berwarna biru/ungu

Pada pengujian larutan albumin, menunjukkan uji positif terhadap uji ninhidrin. Hal ini ditunjukkan dengan terbentuknya larutan berwarna ungu ketika larutan tersebut ditambahkan dengan ninhidrin dan dipanaskan. Hal serupa juga terjadi pada pengujian fenilalanin, tirosin, glisin, sistein dan triptofan, ketika ditambahkan dengan ninhidrin dan kemudian dipanaskan, asam-asam amino tersebut membentuk larutan berwarna ungu. Hal ini menunjukkan bahwa pada asam-asam amino tersebut terdapat α-amino bebas.


 

  1. Uji PbS

Pada uji ini, larutan sistein ditambahkan dengan NaOH dan Pb-Asetat. Hal ini dilakukan untuk mengetahui keberadaan unsur belerang dalam asam amino sistein. Berdasarkan hasil pengamatan dapat diketahui bahwaasam amino sistein positif mengandung belerang, dengan terbentuknya endapan hitam PbS.

Ketika larutan sistein ditambahkan dengan NaOH, larutan menjadi keruh. Hal ini disebabkan karena penambahan NaOH menyebabkan belerang yang terdapat pada asam amino sistein terurai menjadi ion sulfida. Selanjutnya, dengan penambahan Pb-Asetat, ion sulfida yang terlepas dari sistein akan bereaksi dengan ion Pb2+ dari Pb- Asetat membentuk endapan hitam, PbS.

Persamaan reaksinya:

S2+(aq) + Pb2+(aq)      PbS(s)


 

  1. Reaksi Nitroprusida

Gugus sulfidril dalam larutan sistein akan bereaksi dengan natriumprusida dalam amonia berlebih membentuk kompleks berwarna merah. Pada pengujian ini penambahan natriumprusida dan amonia ke dalam larutan sistein menimbulkan warna merah. Warna merah ini dihasilkan dari reaksi antara gugus –SH dari sistein dengan natriumprusida dalam larutan amoniak. Hal ini menunjukkan uji positif terhadap reaksi nitroprusida. Adapun persamaa reaksinya adalah sebagai berikut:


 

Penambahan amonia pada pengujian ini berfungsi sebagai kation kompleks yang nantinya menggantikan posisi Na+ sebagai kation.


 


 


 


 


 


 


 

UJI SAMPLE UNKNOWN

  1. Uji Sample 1

Pada pengujian sample 1, dilakukan uji Millon, uji Hopkins-Cole, uji Ninhidrin, uji PbS dan reaksi nitroprusida. Dari kelima uji yang dilakukan, sampel 1 hany menunjukkan uji positif terhadap uji ninhidrin dengan terbentuknya warna biru. Dengan demikian sampel 1 adalah sam amino fenilalanin.

  1. Uji Sample 2

Pada pengujian terhadap sampel 2 juga dilakukan lima uji. Dari kelima uji yang dilakukan, sampel 2 menunjukkan uji positif terhadap uji Hopkins-Cole dengan terbentuknya cincin ungu dan uji ninhidrin dengan terbentuknya warna biru. Jadi dapat disimpulkan bahwa sampel 2 adalah triptofan.

  1. Uji Sample 3

Pengujian terhadap sampel 3 juga dilakukan lima uji. Dari kelima uji yang dilakukan, sampel 3 menunjukkan uji positif terhadap uji Hopkins-Cole dengan terbentuknya cincin ungu dan uji ninhidrin dengan terbentuknya warna biru. Jadi dapat disimpulkan bahwa sampel 3 adalah triptofan.


 

  1. SIMPULAN

    Dari hasil pembahasan dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut:

    1. Larutan albumin menunjukkan uji positif terhadap uji Millon dan uji Hopkins-Cole.
    2. Uji Millon digunakan untuk uji tirosin, uji Hopkins-Cole untuk uji triptofan, uji ninhidrin untuk uji gugus asam amino bebas, uji Pbs dan nitroprusida untuk uji sistein.
    3. Untuk sampel unknown:
  • Sampel 1 mengandung asam amino fenilalanin
  • Sampel 2 mengandung asam amino triptofan
  • Sampel 3 mengandung asam amino triptofan


 


 


 


 


 


 

  1. DAFTAR PUSTAKA

    Fessenden, F dan Fessenden. 1994. Kimia Organik Jilid 2. Jakarta: Erlangga

    Girindra, Aisyah.1993. Biokimia I. Jakarta: PT. Gramedia

    Nurlita, Frieda.dkk. 2002. Kimia Organik II. Singaraja: IKIP N Singaraja

Poedjadi, Ana dan Titin Supriyanti. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: Universitas Indonesia

Wirahadikusuma, Muhamad. 2001. Biokimia: Protein, Enzim dan Asam Nukleat. Bandung: Penerbit ITB

    http://jlcome.blogspot.com/2007/10/pengetahuan-protein.html


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 

 

Tidak ada komentar:

Poskan Komentar